军科院首次成功将肝类器官用于登革热病毒感染及抗病毒药物筛选

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一、研究背景

登革病毒（DENV）是全球最快速扩张的蚊媒病毒，每年感染1–4亿人，目前无特效抗病毒药物。

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传统模型（动物或2D细胞系）难以模拟人类肝脏严重病理变化，亟需更真实的人类模型。

二、研究亮点

首次利用 人类多能干细胞（hPSC）来源的肝脏类器官（hPLO），成功复现DENV-2感染及严重肝损伤。

通过单细胞RNA测序发现增殖型肝细胞样细胞为DENV-2主要靶细胞，伴随线粒体损伤与细胞组成改变。

筛选出两种新型抗DENV候选药物：Oxyresveratrol（ORES）和 Omaveloxolone（RTA 408），通过激活NRF2通路减轻氧化应激、保护线粒体功能。 药物效果进一步在AG6小鼠模型中验证，显著降低肝脏和血清病毒载量。

三、hPLO类器官详细培养步骤

1. 诱导多能干细胞（hiPSC/hESC）准备

- 细胞来源：商业hiPSC（Cellapy）或hESC（H1、H9）。

- 培养条件：无饲养层，Matrigel包被，E8培养基，每日换液，5天传代。

2. 二维（2D）阶段：肝脏谱系诱导

3. 三维（3D）阶段：类器官形成与成熟

（1）类器官初始形成（Day 10–20）

消化：Accutase解离HS细胞为单细胞。

包埋：5000–20000细胞/30–50 μL Matrigel滴，形成圆顶（dome）。

培养基（BDM）：Advanced DMEM/F12 + B27 + N2 + HEPES + N-乙酰半胱氨酸 + 烟酰胺 + 胃泌素 + Forskolin（10 μM）+ A83-01（5 μM）+ Wnt3a（100 ng/mL）+ R-spondin1（250 ng/mL）+ EGF（50 ng/mL）。

培养：24孔超低吸附板，每2–3天换液。

（2）扩增与传代（Day 20–25）

机械切割：将类器官剪成30–100 μm碎片，每7–10天传代。

冻存：无血清冻存液（Stem Cell）。

（3）成熟阶段（Day 25–50）

预处理：BDM + 0.1% BSA + BMP7（25 ng/mL）+ FGF4（25 ng/mL）+ HGF（50 ng/mL），4天。

重新聚集：单细胞接种（1–3×10^5/孔）形成3D聚集体。

成熟培养基（MHM）：HCM（无EGF）+ B27 + N-乙酰半胱氨酸 + 抗坏血酸 + Y-27632 + HGF（20 ng/mL）+ OSM（20 ng/mL）+ 地塞米松（0.5 μM），3天。

最终成熟：MHM + ITS（1%）+ 地塞米松（0.5 μM）+ EGF（10 ng/mL）+ 8-Br-cAMP（100 μM）+ VK2（10 μM）+ LCA（10 μM），每2天换液，持续≥8天。

4. 类器官功能验证

标志物：ALB、AFP、HNF4A、A1AT、TF、KRT19、KRT7、PDGFRβ等。

功能检测：ICG摄取/释放、糖原储存（PAS染色）、CYP3A4/2C9活性、ALB/AAT/尿素分泌、胆管形成（CDFDA/Rhodamine 123转运）。

四、DENV-2感染与药物筛选

感染模型：Day 25 hPLO碎片（1 PFU/碎片），3h吸附后Matrigel重包埋。

表型：感染后2天出现明显细胞死亡，6天>90%类器官形态恶化。

药物筛选：7DMA、JNJ1802、ORES、RTA 408显著抑制病毒复制，恢复类器官功能。

五、结论

该研究建立了高度生理相关的人类肝脏类器官平台，为DENV感染机制研究和抗病毒药物开发提供了强大工具。

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发布于：北京市